2、转膜效率低：转膜效率受多种因素影响，包括蛋白的大小、凝胶中丙烯酰胺的百分比、电场强度、转印时间和缓冲液的PH值。一般来说，蛋白越大，转移的越慢。转移大蛋白最好的方法是用高的电场强度。而小蛋白长时间处于高电场强度下可能会传出转印膜。

避免这个问题的方法是用0.2μm孔径的PVDF膜进行转印。如果蛋白的等电点接近缓冲液的pH值，那么这个蛋白携带的电荷很少，在电场中页几乎不移动。如果你的目的蛋白是强碱性的，那么你可以用碳酸盐(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性缓冲液。

在转印之后，你可以通过染胶或第二块膜来判断转印效率。为了帮助你直接监控转印效率，使用预染Marker，它们在电泳以及转膜之后可直接观察到。

试剂放置太久或存放条件不正确：抗体会慢慢降解，如果反复冻融的话，它会快速降解。底物应储存在-20℃。

3、抗体不纯或滴度太低：一抗的浓度差异很大，应该根据经验来决定一抗的稀释度。过犹不及，太多的抗体页会阻碍抗原与抗体的结合。一般的原则是以1：100-1:1000来稀释血清或组织培养上清，以1：1000-1：10000来稀释腹水或超免疫动物的血清。Bio-Rad的印迹级别的二抗稀释度是1：3000。

4、酶失活了：叠氮钠是辣根过氧化物酶的抑制剂。不要再HRP显色的Western blot中使用任何含叠氮钠的试剂。叠氮钠可以用于碱性磷酸酶结合的抗体中，而无副作用。另外，只能使用蒸馏的去离子水。

5、使用Tween-20洗涤：Tween-20(吐温-20)可能会干扰某些抗体-抗体相互作用，或洗去PVDF膜上的目的蛋白。尽管在洗涤时它的终浓度只有0.05%-0.1%，但仍可能会影响结合。因此除了封闭之后的第一次洗涤，其他洗涤过程中都不使用Tween-20，不过，这可能会使背景升高。

6、检测系统缺乏足够的灵敏度：确保蛋白的上样量在检测系统的灵敏度范围内：

辣根过氧化物酶 500pg/band

碱性磷酸酶 100pg/band

增强的碱性磷酸酶 5pg/band

胶体金 100pg/band

增强的胶体金 10pg/band Immun-Star

化学发光 10pg/band